SPE固相萃取技术（仪器装置）之如何建立固相萃取方法

SPE固相萃取技术（仪器装置）之如何建立固相萃取方法

6.如何建立固相萃取方法

6.1固相萃取基本步骤

固相萃取的步骤视萃取机理及检测手段可多可少。对于反相固相萃取柱而言，其基本步骤有五步：

             － 固相萃取柱预处理

             － 样品添加

             － 固相萃取柱洗涤

             － 固相萃取柱干燥

             － 目标物洗脱

固相萃取柱预处理

      无论是自行装填的还是商品化的固相萃取柱在使用之前都是以干燥的状态存在的。如同新购置的HPLC柱一样，在使用时都必须先对柱子进行活化、平衡。对于反相固相萃取柱而言，进行柱子预处理的主要目的有两个：

     对固相柱进行活化，展开碳氢链增加和分析物作用的表面积。

     对固相柱进行清洗，除去柱上吸附的对分析有影响的杂质。

     在具体操作上，一般程序是：先用甲醇或极性有机溶剂淋洗柱子，然后再用水或缓冲溶剂除去多余的有机溶剂。因为上述有机溶剂都是良好的洗脱剂，过多的存在会使目标化合物在吸附过程中损失。当用离子交换 SPE 时, 必须注意系统的pH。其pH值应该与样品保持一致。如果使用的是手工的操作方法，必须注意在加样于固相柱前已处理好的固相萃取柱必需保持湿润。 这点对于非高聚物的固相萃取柱尤为重要。否则会出现回收率低、重现性差的结果。

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?样品添加

     将样品添加于固相柱中，用正压或负压使样品通过柱子。样品的流速必须控制。慢流速有利于对目标化合物的吸附。但是，流速过慢会增加整个萃取过程的时间，降低样品处理的通量。另外，过慢的流速会造成杂质被吸附的机会增加，对目标化合物的检测分析不利。 一般对于100毫克填料的SPE柱流速在5-10 ml/min。对于以离子交换为作用机理的萃取，样品通过SPE柱的速度应该适当的降低，以保证分析物有足够的时间与SPE柱填料的离子交换功能团发生作用一般控制在1.5-5 ml/min。

固相萃取柱洗涤

     为了减少分析时杂质对目标化合物的干扰，延长仪器的使用寿命，应该尽可能地除去干扰物。因此，在固相萃取中经常会通过对固相萃取柱的洗涤来达到这个目的。选用适当的洗涤剂选择性地洗脱吸附力弱杂质而保留分析物于柱上。洗涤剂的选择也取决于zui后的分析手段。不同的检测手段对样品的“干净"程度也不同。

固相萃取柱干燥

      如zui后的洗脱剂为缓冲溶液或水溶性有机溶剂，而分析手段为反相 HPLC，固相柱上的残留水对分析影响不大。但是，当水溶性差的有机溶剂为洗脱剂或分析手段为GC或GC-MS时，固相萃取柱的干燥就特别重要。水溶性差的有机溶剂作为目标物的洗脱溶液时，水的存在会直接影响洗脱效率。而样品中大量水分的存在将对GC分析柱造成致命性的损害。

目标物洗脱

      目标化合物的洗脱在整个固相萃取过程中是至关重要的zui后一步。为了zui大限度地将目标化合物洗脱下来，必须选择适当的洗脱溶剂。选择洗脱溶剂时必须考虑以下几个因素：

洗脱剂必需有足够强度，以zui小用量将分析物洗脱下来。洗脱剂必需有足够的选择性只将分析物洗脱，而将吸附力强的杂质保留在柱上。

     在选择洗脱溶剂时，可以通过改变溶剂的极性指数、溶剂强度、溶剂选择性来达到的分离效果。

     洗脱溶剂通过柱子的流速也必须控制。流速慢有利于目标化合物的洗脱。但是，会增加萃取时间，降低效率；同时，过慢的流速可能会造成zui后洗脱馏分中杂质的增加，对检测分析不利。

6.2相关信息的汇集

要建立一个好的固相萃取方法应该综合考虑许多因素。其中首先要做的就是汇集所有可能得到的信息。这些信息主要包括：

目标化合物

  － 化学结构

  － 可生成离子化合物的pKa

  － 浓度

  － 估计样品体积

  － 溶解度

  － 稳定性

样品基质

  － 基质的类型

  － pH值及离子强度

  － 对目标化合物萃取的干扰

分析手段

  － zui终的分析手段

  － 分析方法可使用的溶剂

  － 现有的HPLC方法

    在具体实施中可以通过填写下列表格来确定初步的固相萃取参数：

SPE固相萃取技术（仪器装置）之如何建立固相萃取方法?

6.3固相萃取材料的选择

在选择固相萃取柱时，首先要考虑的是选择哪种萃取机理对目标化合物进行萃取。以下是根据萃取机理选择萃取填料类型的示意图：

根据化合物的lg Kow选择固相萃取材料

      辛醇-水分配系数 Kow 是有机化合物在辛醇和水两相平衡浓度比，Kow反映了该有机化合物的亲脂性或亲水性的程度。在固相萃取中，可以根据 lg Kow 的大小来选择固相萃取柱。通常，lg Kow >3为非极性化合物；lg Kow在1-3之间为中等极性化合物；lg Kow <1为极性化合物；lg Kow <0为水溶性化合物。

6.4选择固相萃取溶剂

溶剂的选择一般包括两个方面：洗涤溶剂的选择和洗脱溶剂的选择。

      对于洗涤溶剂而言，我们希望的洗涤溶剂能够zui大限度地将可能对目标化合物分析及对检测仪器带来干扰及损害的物质除去。同时，又能zui大限度地保证分析物在洗涤过程中不会有明显的损失。下表是选择洗涤溶液的一些基本原则。

     洗脱溶液用于将目标化合物从固相萃取柱上洗脱下来。

固相萃取中常见溶剂的性质

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6.5选择固相萃取的流速

在固相萃取过程中，有三个步骤涉及到液体通过固相萃取柱的流速：样品过柱、洗涤及洗脱。其中，样品过柱的流速及洗脱液过柱的流速对结果的影响较大。

     样品过柱的流速的选择可以参考下表：

      洗脱溶剂的流速与洗脱溶剂的用量有关。溶剂用量大，溶剂过柱的流速可以加快。但是一般的洗脱原则是洗脱溶剂的体积越小越好。因为洗脱溶剂体积小，有利于洗脱物的后处理。如减少浓缩时间或无需浓缩。对于以硅胶为基质的固相萃取柱，洗脱溶剂的用量及其过柱的流速可以参考下表：

SPE固相萃取技术（仪器装置）(八)之如何建立固相萃取方法

参考资料：857体育赛事直播平台下载  

SPE固相萃取技术（仪器装置）(九)之固相萃取参数的优化

7. 固相萃取参数的优化

在建立了初步的固相萃取方法后就可以用空白样品添加目标化合物后对添加物进行萃取。然后，根据分析结果对初步的固相萃取方法进行优化，以达到zuijia的效果。优化过程主要考虑的因素有：

   回收率是否达到检测要求？

能否将萃取过程缩短以提率？

能否将溶剂使用量减少以节省成本、提率、减少污染？

  如果检测结果发现回收率较低，应该首先检查整个操作过程是否有错。如果没有，就要从方法本身查找原因了。可以从以下几个方面着手检查：

1. 洗涤溶剂是否合适

 － 理想的洗涤溶剂是溶于基质，但对目标物溶解度低。

2.目标化合物是否没有*洗脱

 － 选择更强的洗脱溶剂（如改变pH、离子强度、有机溶剂%含量）

 － 选择作用力相对较弱的SPE柱

3.目标化合物是否没有被*吸附

  可以采用原萃取方法以双柱叠加的方式将两个性质相同的固相萃取柱串连在一起进行柱子预处理及样品添加操作，然后将两根柱子分开，分别对两根萃取柱洗脱。如果在下方的柱子上发现有目标化合物就表明目标化合物在萃取过程发生了穿透。也就是说目标化合物在样品添加过秤中没有按照方法设计要求不很好地吸附。有部分目标化合物在样品添加过程中随样品基质穿过固相萃取柱。发生穿透的原因可能是：萃取机理选择的不合适；固相萃取柱的吸附容量不够。目标化合物没有被*吸附还有另外一种可能性就是对于某些样品来说，由于部分目标化合物没有呈游离状态。如生物样品中的目标化合物与蛋白质结合在一起，所以随着样品基质通过固相萃取柱。

4、目标化合物与固相萃取填料功能团之间的吸附作用过强

 洗脱溶剂的洗脱强度不足以将目标化合物全部洗脱下来。这种情况可以改用吸附力较弱的固相萃取柱或改用洗脱强度更大地溶剂进行洗脱。

 在达到预期回收率的前提下，我们希望萃取过程越短越好。提率可以从以下几个方面入手：

 1、提高流速。包括预处理溶液流速、样品过柱流速。

 2、减少洗脱溶液的体积

放射性同位素法优化固相萃取参数

在有条件的实验室，可以通过放射性标记物来查找回收率偏低的原因，优化固相萃取参数。通过同位素示踪的方法可以快速查出回收率偏低的原因，从而优化固相萃取参数。

统计学方法优化固相萃取参数

  应用统计学方法或相关的软件（如：Design of Experiment, DOE）可以减少实验次数，加快固相萃取方法的建立与参数的优化。

8.基质分散 固相萃取 (MSPD)

基质分散固相萃取原理与操作

基质固相分散萃取（Matrix Solid Phase Dispersion, MSPD）是Barker等人在1989年提出，并将其应用于哺乳动物组织中目标化合物的萃取。如下所示，与经典的固相萃取装置不同，MSPD萃取是将样品与固相吸附剂（C18、硅胶等）一起研磨之后，使样品成为微小的碎片分散在固相吸附剂表面。然后将此混合物装入空的SPE柱或注射针筒，用适当的溶剂将目标化合物洗脱下来。

 基质固相分散萃取的主要优点是：适用于固体、半固体及粘稠样品的萃取；萃取溶剂与目标化合物的接触面增大，有利于目标化合物的萃取；溶剂*渗入样品基质中，提高了萃取效率；使用的萃取溶剂比传统的LLE减少约95%，而且所需样品量小、萃取速度也比LLE快约90%。

 经典的基质固相分散萃取是将2 g 固体吸附剂放入无孔的玻璃、铝或玛瑙研磨盆中，并将0.5 g 或0.5 mL样品倒在载体上面。然后用磨棒进行温和的研磨，大约30 sec~45 sec样品基本分散在载体表面。

 将研磨好的样品/吸附剂转移至有塞片或滤纸的空SPE柱或玻璃注射针筒中，也可以根据需要将样品/吸附剂转移至装有吸附剂的SPE柱（例如，氟罗里硅土SPE柱）中。氟罗里硅土SPE柱的作用是吸附基质固相分散萃取共流出干扰物以达到样品净化的目的。也可以将基质固相分散萃取柱叠加在SPE净化柱之上进行洗脱。干燥的氟罗里硅土不但可以对基质固相分散萃取洗脱物进行净化，还可以除去洗脱物中的水分。通常每种洗涤或洗脱溶液的用量为8 mL。洗脱可以利用重力进行，为了提高样品处理的通量，也可以加以真空或正压。洗脱通常是用不同的溶剂按一定的顺序进行，可以按照溶剂的极性大小，由低极性至高极性顺序洗脱，分别收集每个溶剂组分。例如按照正己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯、乙腈、甲醇、水的顺序洗脱。为了减少杂质对目标化合物的干扰，有时也需要对萃取柱进行洗涤或对萃取物进行进一步的净化。

9.分散 固相萃取 (d-SPE)

分散固相萃取（dispersive solid phase extraction, d-SPE）与基质固相分散萃取有相同之处，两者都是使用分散的固相萃取吸附剂而不是经典的固相萃取柱对样品进行萃取。但是，与基质固相分散萃取不同，d-SPE是将固相萃取吸附剂颗粒分散在样品的萃取液中，而不是直接加入到原始样品中。d-SPEzui典型的应用就是在多农药残留检测中使用的QuEChERS样品前处理方法。

QuEChERS萃取方法

QuEChERS (发音：catchers) 是英文 Quick，Easy，Cheap，Effective，Rugged，Safty的缩写。即为：“快速、简易、廉价、有效、稳定、安全"的萃取方法。该方法是Anastassiades等人于2002年在首先在EPRW会议提出，并于2003年正式发表的一个用于农产品中多农药残留物分析的前处理方法。Anastassiades等人zui初旨在针对水果、蔬菜、谷物等低脂农产品而建立一个快速、低花费的多农药残留物样品前处理方法。d-SPE在该方法中被应用于除去样品中的杂质干扰物。该方法已经得到AOAC和欧盟农残监测委员会的认可，并且在食品安全检测实验室得到广泛的使用。

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